Сравнительная характеристика иммунопротективных эффектов бактериальных рибосом, полученных различными способами
Диссертация
Автор: Скобликов, Николай Эдуардович
Название: Сравнительная характеристика иммунопротективных эффектов бактериальных рибосом, полученных различными способами
Справка: Скобликов, Николай Эдуардович. Сравнительная характеристика иммунопротективных эффектов бактериальных рибосом, полученных различными способами Москва, 2005 0 c. :
Объем: 0 стр.
Информация: Москва, 2005
Содержание:
Принятые сокращения
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
11 Рибосома и рибосомный аппарат бактерий
111 Физико-химическая характеристика и структурная организация бактериальных рибосом
112 Понятие о рибосомном аппарате бактерий
12 Феномен рибосомной протекции и современная вакцинология
121 Открытие феномена рибосомной протекции
122 Изучение феномена рибосомной протекции
1221 Специфичность рибосомной протекции
1222 Бактериальные рибосомы и неспецифическая резистентность макроорганизма
1223 Бактериальные рибосомы и специфический гуморальный иммунитет
1224 Бактериальные рибосомы и клеточный иммунитет
1225 Бактериальные рибосомы и феномен тахифилаксии
123 Предполагаемые механизмы рибосомной протекции
124 Препараты на основе бактериальных рибосом
1241 Современные иммунобиологические препараты на основе бактериальных рибосом
1242 Преимущества рибосомных иммунобиологических препаратов
13 Методология изучения феномена рибосомной протекции
131 Методы получения бактериальных рибосом
1311 Общие принципы
1312 Дезинтеграция бактериальных клеток и получение лизата
1313 Выделение рибосомных фракций
13131 Ультрацентрифугирование
13132 Химическое фракционирование
13133 Хроматография
132 Инфекционная модель как инструмент изучения рибосомной протекции
1321 Экспериментальные модели изучения протективных эффектов препаратов бактериальных рибосом
1322 а-Гемолизин кишечной палочки как основа моделирования экспериментального патологического процесса
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
21 Характеристика штаммов бактерий
22 Получение биомассы и дезинтеграция бактериальных клеток
221 Культивирование бактерий
222 Буферные системы
223 Расчёт выхода биомассы
224 Дезинтеграция бактериальных клеток
23 Выделение рибосомных фракций
231 Расчёт выхода рибосомных фракций
232 Выделение рибосомных фракций методом дифференциального ультрацентрифугирования
233 Выделение рибосомных фракций методом гель-фильтрации
24 Хранение рибосомного материала
25 Контроль качества полученных препаратов
251 Спектрофотометрический анализ
252 Седиментационный анализ
253 Электрофоретический анализ
2531 Электрофорез рибосомных белков
2532 Электрофорез рибосомной РНК
26 Исследование протективных свойств бактериальных рибосом на экспериментальных моделях
261 Получение а-гемолизина Е coli
262 Определение DL50 а-гемолизина Е coli
263 Модель острой интоксикации а-гемолизином Е coli in vivo
264 Иммунизация лабораторных животных препаратами бактериальных рибосом и оценка вызываемого ими протективного эффекта
265 Модель гемолиза in vitro и определение гемолитической активности а-гемолизина Е coli
266 Инкубация эритроцитов с препаратами бактериальных рибосом и оценка вызываемого ими протективного эффекта
27 Изучение иммунологической специфичности препаратов бактериальных рибосом, полученных различными методами
271 Получение антирибосомных антисывороток
272 Определение антирибосомных антител в сыворотках иммунизированных животных
273 Реакция преципитации антирибосомных антител с а-гемолизином Е coli
274 Реакция нейтрализации токсина антирибосомными антителами in vivo
28 Статистическая обработка результатов исследований
ГЛАВА 3 БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОЛУЧЕНИЯ
ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИБОСОМ
31 Выход биомассы
32 Выход рибосомной фракции, полученной методом дифференциального ультрацентрифугирования
33 Выход рибосомной фракции, полученной методом гель-фильтрации
34 Характеристика физико-химических свойств полученных препаратов бактериальных рибосом
341 Спектрофотометрический анализ
342 Седиментационный анализ
343 Электрофоретический анализ
3431 Электрофорез рибосомных белков
3432 Электрофорез рибосомной РНК
ГЛАВА 4 АНТИТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИБОСОМ, ПОЛУЧЕННЫХ РАЗЛИЧНЫМИ МЕТОДАМИ
41 Исследование антитоксических протективных свойств препаратов бактериальных рибосом на модели острой интоксикации белых мышей а-гемолизином Е coli
42 Исследование антитоксических протективных свойств препаратов бактериальных рибосом на модели гемолиза in vitro
ГЛАВА 5 ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИБОСОМ, ПОЛУЧЕННЫХ РАЗЛИЧНЫМИ МЕТОДАМИ
51 Особенности индукции синтеза антирибосомных антител
52 Взаимодействие антирибосомных антител с а-гемолизином
Е coli in vitro
53 Токсиннейтрализующий эффект антирибосомных антител в отношении а-гемолизина Е coli in vivo
Введение:
Актуальность темы
Наиболее эффективным и экономичным способом снижения инфекционной заболеваемости является использование иммунобиологических препаратов (Воробьёв А. А., 1999;
Покровский В. И., Семёнов Б. Ф., 1999), прежде всего — вакцины. Совершенствование вакцинных препаратов связано с поиском новых эффективных иммуногенов, обладающих протективной активностью. Среди протективных антигенов, используемых для производства современных химических вакцин особое место занимают бактериальные рибосомы (Медуницын Н. В., 1999).
К середине XX века была окончательно выяснена роль рибосом, как главного и наиболее сложного компонента трансляционной системы (Шапвиль Ф., Энни Э.-Л., 1977; СпиринА. С., 1986). Среди свойств рибосом особое место занимает феномен рибосомной протекции, который заключается в способности рибосом, выделенных из патогенных микроорганизмов и введённых в восприимчивый макроорганизм, защищать его от соответствующей гомологичной, а в некоторых случаях и гетерологичной инфекции.
Начиная с первого сообщения (Youmans A. S. и Youmans G. Р., 1965), изучение иммунопротективных свойств рибосом оформилось в самостоятельное направление современной вакцинологии (Левенсон В. И., Хазанова В. В., 1991; Eisenstein Т. К. et al., 1976; Lieberman М. М. et al., 1979; Dussourd d'Hinterland L., 1980; Gregory R. L., 1986; Segal E., 1989; Nicolaeva L. V., Savel'ev E. P., 1991; Normier G. et al., 1992 и др.).
К бесспорным достоинствам рибосомных препаратов можно отнести их низкую токсичность и реактогенность, высокую иммуногенность и способность создавать перекрёстный иммунитет к различным серотипам возбудителей в пределах вида (Левенсон В. И. и др., 1988; Бакулин И. Н.,
Сергеева Т. И., 1990; Оветчин П. В., Цыганенко А. Я., 1984). Препараты на основе бактериальных рибосом в настоящее время вышли за рамки классических вакцин, широко применяются в качестве иммуномодуляторов и демонстрируют свою эффективность (Хаитов Р. М. и др., 1994; Гордиенко С. М., Ласица О. И., Федорчук А. Г., 1995). Перспективность разработки рибосомных иммунобиологических препаратов обусловлена также необходимостью использования для коррекции различных иммунопатологических состояний средств, нормализующих нуклеиновый обмен, поскольку иммунные расстройства связаны с нарушениями метаболизма, прежде всего — нуклеинового обмена (Караулов А. В., 1999). Высокая протективная и иммуномодулирующая активность бактериальных рибосом позволяет рассматривать их в качестве основы для конструирования вакцинных препаратов нового поколения.
Одной из главных проблем развития данного направления является сложность получения рибосомного материала и, как следствие, высокая себестоимость соответствующего целевого продукта. Получивший наибольшее распространение метод дифференциального ультрацентрифугирования клеточного лизата бактерий позволяет получать препараты высокого качества, однако является весьма громоздким и требующим дорогостоящего оборудования, сложного в эксплуатации. Исходя из того, что технология дифференциального ультрацентрифугирования не может быть основой для вакцинного производства, так как производительность этого способа резко ограничена небольшой ёмкостью высокоскоростных роторов, исследователями велись поиски альтернативных методов выделения рибосомных фракций для иммунобиотехнологических целей. Прежде всего, стали рассматриваться варианты химического фракционирования (Лиходед В. Г. и др., 1973; Левенсон В. И. и др., 1984), которые, несмотря на преимущества, обладают рядом недостатков. Химическое фракционирование отличается низким выходом продукта (Орлов В. Г., 1991) и, кроме того, не позволяет получить интактную фракцию рибосом (Крылов В. П., 1996), что затрудняет его внедрение в промышленное производство рибосомных иммунобиологических препаратов. В то же время известно, что при исследовании структурно-функциональной организации прокариотических рибосом успешно применялся метод эксклюзионной хроматографии на колонке (гель-фильтрации) для получения препаративных количеств рибосомного материала (Jelenc Р. С., 1980). Поэтому целесообразно разработать методику получения экспериментальных рибосомных препаратов с помощью гель-фильтрации и исследовать протективные свойства целевого продукта.
Несмотря на множество публикаций, посвященных изучению разных аспектов феномена рибосомной протекции, вопрос о природе протективной активности рибосом, а также о механизмах её реализации остаётся до настоящего времени неразрешённым. Исследования, проводимые на различных моделях, дали обширный материал для построения гипотез о возможных механизмах рибосомной протекции (Youmans A. S., Youmans G. Р., 1965; Gonggrijp R. et al., 1980, 1981; AngermanC., Eisenstein Т., 1980; Robert D. et al., 1981; Venneman M. R., Bigley N. J., 1969; Smith R. L. et al., 1974; Левенсон В. И. и др., 1988, 1991; Крылов В. П., 1996). Однако абсолютное большинство исследований проводилось с рибосомами, выделенными из вирулентных микроорганизмов, обладающих широким набором факторов патогенности. Это обстоятельство не позволяет вскрыть механизмы рибосомной протекции на молекулярном уровне, принимая во внимание, что протективный иммунитет обусловлен способностью иммунной системы блокировать реализацию патогенного потенциала возбудителя в макроорганизме (Хаитов Р. М., Игнатьева Г. А., Сидорович И. Г., 2000). Представляется очевидным, что исследования на моделях, связанных с действием только одного фактора патогенности, более перспективны в плане расшифровки молекулярных механизмов протективного действия бактериальных рибосом. К таким моделям можно отнести проявление биологической активности бактериальных токсинов in vivo и in vitro.
К настоящему времени крайне ограничено количество исследований протективной активности 70S рибосом на моделях токсического действия бактериальных экзотоксинов: известны эксперименты с энтеротоксином штамма Е. coli 015 (Лиходед В. Г., Табачник А. Л., Темпер Р. М., 1974) и токсином Clostridium perfringens типа «А» (Ефимова М. Г., 1998).
В качестве основы для модели изучения антитоксической рибосомной протекции нам представляется весьма привлекательным использование а-гемолизина Е. coli. Этот токсин играет важную роль в инфекционной патологии, являясь одним из главных факторов вирулентности уропатогенных штаммов кишечной палочки, ответственных за развитие сепсиса, токсического отёка лёгких, поражении почек и нижних отделов мочевыводящего тракта эшерихиозной этиологии (Бондаренко В. М., Голубев А. В., 1988).
Имеется значительное количество публикаций, посвящённых расшифровке структуры биомолекулы а-гемолизина Е. coli, изучению генетического контроля её синтеза и механизма действия (Палкина Н. А., Кушнарёв В. М., Мельников С. Я., 1975; Палкина Н. А., 1976; Ратинер Ю. А., Канарейкина С. К., Бондаренко В. М., Голубева И. В., 1976; Фаворов В. В. и др., 1984; Шмитт К. К., Мейсик К. С., О'Браэн А. Д., 2000). Исследование антитоксической протективной активности 70S рибосом на модели токсического действия а-гемолизина гомологичного штамма кишечной палочки позволит углубить представления о механизмах реализации протективного феномена бактериальных рибосом.
Цель и задачи исследования, основные экспериментальные подходы
Целью данной работы являлось сравнение иммунопротективных эффектов препаратов 70S рибосом, выделенных из кишечной палочки (Escherichia coli) методом дифференциального ультрацентрифугирования и методом колоночной хроматографии (гель-фильтрации), на модели интоксикации лабораторных животных а-гемолизином Е. coli для совершенствования качества и технологии получения медицинских иммунобиологических препаратов на основе бактериальных рибосом.
Задачи исследования состояли в следующем:
1. Разработать схему получения 70S рибосом методом гель-фильтрации для изучения их иммунопротективных свойств.
2. Провести сравнительный анализ физико-химических параметров препаратов 70S рибосом Е. coli, полученных методом дифференциального ультрацентрифугирования и методом гель-фильтрации.
3. Подобрать схемы иммунизации лабораторных животных и экспериментальные модели действия а-гемолизина штамма Е. coli, используемого для выделения 70S рибосом.
4. Выявить различия способности обеспечивать защиту от действия а-гемолизина Е. coli препаратов 70S рибосом различных штаммов кишечной палочки, полученных методом дифференциального ультрацентрифугирования и методом гель-фильтрации.
Основные экспериментальные подходы, применяемые для решения поставленных задач, заключались в:
• выделении рибосомных фракций иследуемых штаммов бактерий методами дифференциального ультрацентрифугирования и гель-фильтрации;
• спектрофотометрическом, седиментационном и электрофоре-тическом анализе качества препаратов 70S рибосом, полученных различными методами;
• получении препаративных количеств а-гемолизина штамма Е. coli DH1, несущего плазмиду гемолиза pRDl;
• оценке антитоксической защиты от летального действия а-гемолизина Е. coli, вызываемой введением лабораторным животным препаратов 70S рибосом, полученных различными методами, на экспериментальной модели;
• оценке способности препаратов 70S рибосом, полученных различными методами, обеспечивать защиту эритроцитов от действия а-гемолизина Е. coli in vitro;
• получении кроличьих сывороток, содержащих антитела против 70S рибосом, полученных различными методами.
Новизна результатов
Впервые проведён сравнительный анализ иммунопротективных свойств 70S рибосом различных штаммов кишечной палочки, полученных методом дифференциального ультрацентрифугирования и методом гель-фильтрации.
Впервые обнаружено снижение антитоксической протекции препаратов 70S рибосом, полученных методом гель-фильтрации, по сравнению с препаратами, полученными методом дифференциального ультрацентрифугирования, на модели острой интоксикации белых мышей а-гемолизином Е. coli.
Впервые установлена способность препаратов 70S рибосом, полученных методами дифференциального ультрацентрифугирования и гель-фильтрации, нейтрализовать гемолитическую активность а-гемолизина гомологичного штамма кишечной палочки in vivo и in vitro.
Впервые установлена способность антирибосомных антител, полученных иммунизацией кролика препаратами 70S рибосом, полученными методами дифференциального ультрацентрифугирования и гель-фильтрации, нейтрализовать гемолитическую активность а-гемолизина гомологичного штамма кишечной палочки in vivo.
Основные положения, выносимые на защиту
• Метод гель-фильтрации позволяет получать 70S рибосомы для иммунобиотехнологических целей.
• 70S рибосомы гемолитического штамма кишечной палочки независимо от способа получения рибосомного материала, способны индуцировать тахифилаксию мышей к действию а-гемолизина и нейтрализовать in vitro гемолитическую активность а-гемолизина.
• Протективная активность рибосомных препаратов зависит от способа фракционирования клеточного лизата и наличия факторов вирулентности у штамма-источника рибосомного материала.
Научно-практическое значение работы
Метод гель-фильтрации клеточного лизата обладает по сравнению с методом, дифференциального ультрацентрифугирования рядом, технологических преимуществ, позволяющих упростить процесс получения препаратов бактериальных рибосом для иммунобиотехнологических целей.
Способность 70S рибосом из гемолитических штаммов кишечной палочки вызывать в эксперименте на мышах тахифилаксию к а-гемолизину Е. coli и нейтрализовать in vitro гемолитическую активность данного бактериального экзотоксина открывает перспективы разработки новых антитоксических препаратов на основе бактериальных рибосом.
Внедрение результатов в практику
Результаты исследований опубликованы в открытой печати (10 работ). Основные положения диссертации докладывались на научно-практических конференциях молодых ученых и студентов Кубанской государственной медицинской академии (г. Краснодар, 1999); Научно-практической конференции молодых учёных "Развитие социально-культурной сферы Северо-Кавказского региона" (Краснодар, 2001); IV Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001); VIII международном конгрессе по иммунореабилитации «Аллергия, Иммунология и Глобальная Сеть» (Cannes, France, 2002); V Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003); XVI зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004).
Результаты исследований внедрены в научную работу ЦНИЛ Кубанской государственной медицинской академии (отдел экспериментальной и клинической иммунологии, отдел молекулярной биологии бактерий), Российского центра функциональной хирургической гастроэнтерологии МЗ РФ (отдел клинической микробиологии, отдел клинической и экспериментальной иммунологии), отдела микробиологического синтеза Северо-Кавказского НИИ биотехнологии и химии.
Новые данные о механизмах реализации антитоксического протективного эффекта, индуцированного препаратами бактериальных рибосом, используются учебном процессе на кафедре микробиологии Кубанской государственной медицинской академии и кафедре генетики и микробиологии Кубанского государственного университета.
