Главная » 2014 » Июль » 20 » Скачать Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.. Никонова, бесплатно
05:42
Скачать Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.. Никонова, бесплатно
Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.
Диссертация
Автор: Никонова, Александра Александровна
Название: Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.
Справка: Никонова, Александра Александровна. Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени. : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.06 / Никонова Александра Александровна; [Место защиты: ГУ "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток РАМН"] - Москва, 2009 - Количество страниц: 127 с. 14 ил. Москва, 2009 141 c. :
Объем: 141 стр.
Информация: Москва, 2009
Содержание:
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Молекулярно-биологическая и эпидемиологическая характеристика респираторных вирусов lllPHK-содержащие вирусы
1111 Семейство Orthomyxoviridae
1112 Семейство Paramyxoviridae
1113 Семейство Picornaviridae
1114 Семейство Coronaviridae
112 ДНК-содержащие вирусы
1121 Семейство Adenoviridae
1122 Семейство Herpesviridae
1123 Бокавирус человека
12 Методы этиологической диагностики респираторных заболеваний
121 Выделение вируса в культуре чувствительных клеток
122 Иммунологические методы выявления респираторных вирусов
1221 Реакции с использованием химических меток
1222 Реакции, основанные на феномене агглютинации эритроцитов
1223 Методы серологической диагностики
123 Методы амплификации нуклеиновых кислот
1231 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
1232 Мультиплексная ПЦР
1233 ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
1234 Мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
1235 Другие методы амплификации нуклеиновых кислот
1236 Тип образца и методы пробоподготовки
1237 Выявление ингибиторов амплификации и контроль контаминации
1238 Клиническое применение методов амплификации нуклеиновых кислот
Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
21 Материалы
211 Лабораторные штаммы вирусов
212 Клеточные линии
213 Клинические образцы
214 Реактивы
22 Методы
221 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
222 Методика получения мазков из полости носа для диагностики ОРВИ методом ПЦР
223 Выделение вирусных нуклеиновых кислот
224 Реакция обратной транскрипции
225 Полимеразная цепная реакция (моноспецифический формат)
226 Полимеразная цепная реакция (мультиплексный формат)
227 Электрофорез ДНК в агарозном геле
228 Полимеразная цепная реакция с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (TaqMan)
229 Получение калибратора для количественного учета вирусной РНК в биологических образцах
2210Статистическая обработка результатов исследований
Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
31 Подбор праймеров и оптимизация условий выявления ДНК аденовирусов человека в биологических образцах методом ПЦР
32 Подбор праймеров и зондов, оптимизация условий для дифференциального выявления риновирусов и энтеровирусов в биологических образцах методом ПЦР
33 Выявление респираторных вирусов человека в биологических образцах методом мультиплексной ПЦР с детекцией продуктов амплификации в агарозном геле
34 Разработка тест-системы на основе мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для выявления 10 групп респираторных вирусов в биологических образцах
341 Подбор праймеров и зондов, оптимизация условий мультиплексной ПЦР-РВ
342 Сравнительный анализ эффективности и чувствительности мультиплексной и моноспецифической ПЦР-РВ
343 Испытание тест-системы на клинических образцах, полученных от больных с симптомами ОРВИ
35 Количественное определение нуклеиновых кислот респираторных вирусов
Введение:
Актуальность проблемы.
Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) по распространенности и контагиозности занимают ведущее место среди инфекционных болезней человека. В России на грипп и гриппоподобные острые респираторные заболевания приходится более 90% инфекционной заболеваемости [20]. Основной вклад в структуру ОРВИ вносят вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, коронавирусы, аденовирусы, риновирусы и некоторые энтеровирусы [85, 87]. Вирус гриппа опасен осложнениями, которые часто возникают после заражения, и является причиной высокой смертности у пациентов с ослабленным иммунитетом [105, 128]. Первичная респираторно-синцитиальная вирусная инфекция, возникающая обычно у детей первого года жизни, нередко становится причиной смерти новорожденных [4, 213]. Серьезные респираторные заболевания у человека часто вызывают также вирусы парагриппа 1, 2 и 3 типов, аденовирусы, коронавирусы и другие [45, 63, 110]. На сегодняшний день нет сомнений в том, что некоторые респираторные вирусы (респираторно-синцитиальный вирус, риновирусы и аденовирусы) играют важную роль в развитии аллергических заболеваний дыхательных путей, в том числе бронхиальной астмы [51, 112]. Помимо вирусов, многие виды бактерий, хламидий и микоплазм способны поражать дыхательные пути, вызывая сходные с ОРВИ симптомы [69, 120, 243].
С точностью идентифицировать респираторные инфекции можно только при помощи лабораторных методов диагностики. Затруднения при дифференциальной лабораторной диагностике этих инфекций вынуждают вести статистический учет по сумме всех случаев, включая их в комплекс ОРВИ. В ранние сроки болезни для диагностики используют различные методы: выделение вируса заражением культур клеток, иммунофлуоресцентное выявление антигенов вируса в цитоплазме эпителиальных клеток носовой полости, определение нарастания титра антител в парных сыворотках [96, 128]. В настоящее время для выявления и идентификации респираторных вирусов широко используют молекулярные методы, специфичность которых основана на уникальности нуклеотидных последовательностей вирусных геномов [59, 118, 128, 246].
Несмотря на имеющиеся разнообразие методов диагностики вирусных инфекций, остается актуальной проблема быстрой и высокочувствительной диагностики. Выделение вируса в культуре клеток и реакция нейтрализации типоспецифическими сыворотками, считающиеся «золотым стандартом» диагностики, в то же время обладает рядом недостатков, включающими высокую трудоемкость и продолжительность теста. Вирусы размножаются не на всех культурах клеток, поэтому обычно, клинические образцы инокулируют сразу в несколько типов клеток, для того чтобы обеспечить условия для выделения вирусов, с разной тканевой специфичностью, что значительно увеличивает трудоемкость исследования [147, 236]. Кроме того, ряд респираторных вирусов (например, риновирусы, вирус парагриппа 4 типа, метапневмовирус) с трудом выделяются в культуре клеток. Широкое распространение имеют иммунохимические экспресс-методы выявления вирусных агентов в клинических образцах. Основными их преимуществами являются доступность и простота постановки. Однако, в ряде случаев, они бывают недостаточно информативны и неприменимы в отношении таких респираторных вирусов, как риновирусы и аденовирусы из-за их высокого антигенного разнообразия. Приведенные выше данные обусловливают необходимость совершенствования существующих тест-систем для выявления респираторных вирусов.
Решение данной проблемы в последние годы связывают с развитием молекулярно-биологических лабораторных методов, таких как различные модификации метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе ПЦР с гибридизационной идентификацией продуктов амплификации, мультиплексная ПЦР, I а также ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Достоинствами метода ПЦР являются высокая специфичность, чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, возможность выявления сразу нескольких патогенов в одной пробирке, при условии наличия в реакционной смеси нескольких пар соответствующих праймеров (мультиплексная ПЦР).
Внедрение метода ПЦР-РВ в лабораторную практику стало одним из наиболее важных событий в клинической лабораторной диагностике. Применение ПЦР-РВ позволяет проводить выявление продуктов амплификации в процессе реакции и вести количественный учет вирусных нуклеиновых кислот. Подобный подход позволяет отказаться от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации, а также позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории. Некоторые современные приборы для ПЦР-РВ позволяют в одной пробирке проводить и детектировать в режиме реального времени до 6-ти независимых реакций, с использованием зондов, меченных различными флуоресцентными красителями (мультиплексная ПЦР-РВ). Несмотря на очевидные преимущества этого подхода на российском рынке отсутствуют тест-системы на основе мультиплексной ПЦР-РВ для диагностики респираторных вирусных инфекций. Таким образом, разработка мультиплексной ПЦР тест-системы для одновременного выявления в клинических образцах основных возбудителей ОРВИ является весьма актуальной задачей.
Внедрение быстрых тестов на основе мультиплексной ПЦР-РВ для диагностики инфекций дыхательных путей может улучшить качество оказания медицинской помощи и снизить частоту неоправданного назначения антибактериальных препаратов, а также обеспечит эпидемиологические службы удобным и универсальным инструментом для быстрой и высокоспецифичной расшифровки вспышек ОРВИ. :
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования являлась разработка мультиплексной ПЦР-тест-системы с детекцией в режиме реального времени, позволяющей одновременно выявлять в клинических образцах основных возбудителей респираторных вирусных инфекций человека - вирусы гриппа А и В, вирусы парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусы, респираторно-синцитиальный вирус, риновирусы и энтеровирусы.
Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
• в культуре клеток получить образцы лабораторных штаммов вирусов гриппа А и В, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов, риновирусов, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов и энтеровирусов для использования их на следующих этапах работы в качестве биологических стандартов;
• к консервативным геномным последовательностям десяти групп респираторных вирусов подобрать праймеры и зонды (TaqMan) и показать их специфичность в моноспецифической ПЦР в реальном времени;
• оптимизировать условия проведения мультиплексной реакции обратной транскрипции и ПЦР и провести сравнительную оценку эффективности и чувствительности моноспецифической и мультиплексной ПЦР-РВ для выявления различных респираторных вирусов;
• проанализировать клинические образцы от больных с симтомами ОРВИ с помощью разрабатываемой ПЦР-тест-системы и зарубежного аналога, который применяется в Медицинском центре Лейденского университета (Нидерланды), и провести сравнительный анализ результатов, полученных двумя тест-системами;
• отработать методы для количественного учета нуклеиновых кислот респираторных вирусов в биологических образцах.
Научная новизна. '
Впервые в России разработана тест-система, позволяющая методом мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени выявлять в клинических образцах основных возбудителей респираторных вирусных инфекций человека, в частности, вирусы гриппа А и В, вирусы парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусы, респираторно-синцитиальный вирус, риновирусы и энтеровирусы в присутствии внутреннего положительного контроля. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, используемые в тест-системе, были разработаны в процессе выполнения данной работы, то есть являются оригинальными.
Практическая значимость.
1. Мультиплексная тест-система с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени для одновременного выявления основных респираторных вирусов в клинических образцах может применяться в эпидемиологических службах для быстрой расшифровки вспышек ОРВИ и для мониторинга эпидемиологической обстановки. В перспективе, с развитием методов специфического лечения респираторных вирусных заболеваний, подобные тест-системы найдут применение в клинической практике для постановки диагноза и назначения адекватного лечения.
2. Разработанные методические приемы для количественного учета нуклеиновых кислот респираторных вирусов могут быть использованы в научных исследованиях, в частности, для контроля уровня вирусной репродукции, наряду с традиционными методами титрования вирусов, при испытании противовирусных препаратов in vitro и in vivo.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. В ходе выполнения работ, были подобраны нуклеотидные последовательности праймеров и зондов TaqMan для выявления в биологических образцах вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусов, респираторно-синцитиальный вируса, риновирусов и энтеровирусов и показана их специфичность на лабораторных штаммах респираторных вирусов.
2. Разработана мультиплексная ПЦР-тест-система для одновременного выявления 10 групп респираторных вирусов в клинических образцах.
3. Анализ клинических образцов от больных с симптомами ОРВИ показал, что разработанная тест-система не уступает по специфичности зарубежному аналогу.
4. Разработан алгоритм для количественного учета нуклеиновых кислот респираторных вирусов, который был успешно применен в ряде научных исследований.
