Главная » 2014 » Июль » 20 » Скачать Сравнительный анализ активности ретроэлементов в нормальных и опухолевых тканях человека. Леппик, Людмила Паульевна бесплатно
05:55
Скачать Сравнительный анализ активности ретроэлементов в нормальных и опухолевых тканях человека. Леппик, Людмила Паульевна бесплатно
Сравнительный анализ активности ретроэлементов в нормальных и опухолевых тканях человека
Диссертация
Автор: Леппик, Людмила Паульевна
Название: Сравнительный анализ активности ретроэлементов в нормальных и опухолевых тканях человека
Справка: Леппик, Людмила Паульевна. Сравнительный анализ активности ретроэлементов в нормальных и опухолевых тканях человека : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.03 Москва, 2004 130 c. : 61 04-3/765
Объем: 130 стр.
Информация: Москва, 2004
Содержание:
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Классы ретротранспозонов
1 LINE элементы
11 Структура и классификация L1 элементов
12 Распределение L1 по геному человека
13 Функциональная активность L1
Транскрипционная активность
Транспозиционная активность
2 Эндогенные ретровирусы человека
21 Строение HERV
22 Классификация
23 Представленность и локализация HERV и LTR в геноме
24 Распределение HERV и LTR по хромосомам
25 Активность HERV и одиночных LTR
26 Факторы, влияющие на экспрессию HERV
27 Возможное участие ERV в различных нормальных и патофизиологических процессах
ERV: возможное участие в развитии плаценты и эмбриогенезе
Роль HERV в возникновении опухолей
Участие ERV в иммунном ответе организма
Потенциальная роль HERV в возникновении диабета I
Ретротранспозиция и инсерционный мутагенез
ГЛАВА 2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
21 Анализ транскрипционной активности индивидуальных LTR семейства HERV-K
22 Анализ транскрипционной активности индивидуальных LTR HERV-K в нормальных и опухолевых тканях человека
Чувствительность и репрезентативность метода SDDIR
Варианты SDDIR
Транскрипционная активность LTR HERV-K
2 3 Поиск специфичных для опухолей интеграции LTR HERV-K и LINE1
Оценка чувствительности метода TGDA
TGDA опухоль-специфичных интеграций LTR HERV-K и LINE1
Идентификация дифференциальных фрагментов
ГЛАВА 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
31 Материалы
311 Ферменты и реактивы
312 Оборудование
313 Расходные материалы
314 Буферные и другие растворы
315 Микробиологические среды
316 Ткани
317 Праймеры, последовательность нуклеотидов
32 Методы исследования
321 Выделение РНК и геномной ДНК
322 Обработка ДНКазой
323 Синтез первой цепи кДНК
325 Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК и PCR фрагментов
326 Подбор праймеров для амплификации
327 Поиск гомологий, картирование в геноме человека
328 Дифференциальный дисплей SDDIR (Selective Differential Display of RNAs containing Interspersed Repeats)
329 Модифицированный TGDA (Targeted Genomic Difference Analysis)
Приготовление вложенного контроля
ВЫВОДЫ:
Введение:
Около 40% генома человека составляют повторяющиеся элементы, представленные в основном ретроэлементами (далее РЭ), такими как короткие диспергированные повторы (Short Interspersed Nuclear Elements, SINEs), длинные диспергированные повторы (Long Interspersed Nuclear Elements, LINEs) и производными эндогенных ретровирусов (Human Endogenous Retroviruses, HERV), содержащими длинные концевые повторы (Long Terminal Repeats, LTRs), в то время как последовательности, кодирующие белки, составляют менее 5% генома [1, 2].
Часть повторяющихся элементов генома экспрессионно активна. Большое число повторяющихся элементов могут образовывать собственные транскрипты, которые участвуют в функционировании клетки. Ретроэлементы могут образовывать некодирующие РНК, потенциально способные принимать участие в регуляции генной активности, например при посттранскрипционном сплайсинге генов или участвуя в подавлении экспрессии транспозонов и других повторяющихся элементов [3-5]. РНК, содержащие Alu элементы, составляют 5% от известных мРНК [6]. В 5' и 3' UTR многих генных транскриптов присутствуют последовательности ретроэлементов. Особенно богаты последовательностями РЭ транскрипты эволюционно молодых классов генов, таких как гены иммунного ответа или ответа на воздействия внешних факторов [7].
Перемещаясь, РЭ существенно влияют на структуру генетического материала хозяина и имеют фундаментальное значение в формировании генетической изменчивости. Считают, что причиной возникновения спонтанных мутаций может являться транспозиционная активность подвижных элементов генома [8]. Являясь причиной инсерционного мутагенеза, РЭ могут, как изменять последовательность гена, так и изменять его транскрипционную активность, влиять на тканеспецифичность и уровень экспрессии гена. Для некоторых ретроэлементов показано, что они могут быть промоторами и терминаторами транскрипции близлежащих клеточных генов, участвовать в альтернативном сплайсинге, предполагают участие РЭ в ремоделировании хроматина и других процессах [5, 9, 10].
Методами блот гибридизации и PCR было показано, что активность РЭ может изменяться в зависимости от внешних условий и состояния клетки [10]. Показано увеличение количества Alu транскриптов в клетках при стрессовых условиях [11]. Другим хорошо известным примером является изменение картины экспрессии эндогенных ретровирусов и LINE1 элементов в процессе опухолевой трансформации [12, 13]. Все эти данные свидетельствуют о том, что, по крайней мере, некоторые ретроэлементы в процессе эволюции сохранили свой биологический потенциал, но не дают возможности ответить на вопрос, каковы функции РЭ в геноме человека. Остается неясным, какие факторы участвуют в регуляции активности ретроэлементов, сколько и какие элементы подвергаются этой регуляции, как и за счет чего при изменениях внешних условий и клеточного состояния изменяется транскрипционная активность индивидуальных РЭ.
Существует большое число работ, исследующих роль повторяющихся элементов в функционировании клетки, но все они сфокусированы на активности отдельных представителей ретроэлементов [5, 9, 10]. На сегодняшний день не проводили полногеномных исследований транскрипционно активных ретроэлементов и исследований изменения их активности в различных нормальных и опухолевых тканях, так как не существует метода для исследования всего пула РНК, содержащих определенный класс повторяющихся элементов, и позволяющего сравнивать спектры РНК в различных типах клеток и тканей.
В данной работе мы разработали методы, которые могут быть полезны для выяснения вклада активности РЭ в функционирование генома хозяина, и использовали их для полногеномного анализа функциональной активности HERV и LINE элементов и ее изменений при переходе от нормальных тканей к опухолевым.
