Главная » 2014 » Август » 17 » Скачать Определение частоты мутантных клеток по локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора с целью формирования групп риска в бесплатно
22:36
Скачать Определение частоты мутантных клеток по локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора с целью формирования групп риска в бесплатно
Определение частоты мутантных клеток по локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора с целью формирования групп риска в отношении развития рака щитовидной железы
Диссертация
Автор: Верещагина, Анна Олеговна
Название: Определение частоты мутантных клеток по локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора с целью формирования групп риска в отношении развития рака щитовидной железы
Справка: Верещагина, Анна Олеговна. Определение частоты мутантных клеток по локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора с целью формирования групп риска в отношении развития рака щитовидной железы : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.01 Обнинск, 2006 103 c. : 61 06-3/1194
Объем: 103 стр.
Информация: Обнинск, 2006
Содержание:
ГЛАВА ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Изменения генетического материала соматических •клеток нри воздействии ионизирующегоизлучения
111, Индукция соматического мутагенеза (механизмы 12формирования структурных и генных мутаций)
112 Индукция нестабильности генома
12 Ключевая роль мутаций в канцерогенезе
13 Радиационно-индуцированный канцерогенез
14 Методы оценки мутагенеза в соматических клетках поотдельным генным локусам и возможность ихприменения в популяционных исследованиях
15 Высокий уровень соматического мутагенеза, как 30показатель повышенного риска развития онкопатологии
ГЛАВА МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
21 Характеристика обследованных групп
211 Характеристика группы лиц, обследованных с помощьюGPA-теста
212 Характеристика группы лиц, обследованных с помощьюTCR-теста
22 Подготовка проточного цитометра к работе
23 Определение частоты GPA-мутантных клеток
231 Фенотипирование крови доноров
232 Фиксация и окрашивание клеток
233 Биотинилирование антител к М-форме гликофорина А
24 Определение частоты TCR -мутантных клеток
25 Статистический анализ полученных результатов
ГЛАВА РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
31 Частота мутантных клеток в грунпах контрольныхнеоблученных лиц
311 Частота мутантных но TCR-локусу клеток уконтрольных доноров
312 Частота GPA-мутантных клеток у контрольных лиц
32 Частота клеток с генными мутациями у жителейрадиационно-загрязненных территорий Орловскойобласти
321 Частота GPA-мутантных клеток
322 Частота TCR-мутантных клеток
33 Частота клеток с генными мутациями у жителейрадиационно-загрязненных территорий Орловскойобласти в зависимости от возраста на момент началарадиационного воздействия
331 Частота GPA-мутантных эритроцитов
332 Частота TCR-мутантных клеток
34 Частота мутантных клеток у лиц со злокачественныминовообразованиями ЩЖ
341 Частота TCR-мутантных клеток
342 Частота GPA-мутантных клеток
ГЛАВА ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
41 Частота мутантных клеток у контрольных доноров
42 Влияние хронического облучения в малых дозах науровень мутантных клеток по TCR- и GPА-локусам
421 Влияние хронического облучения в малых дозах науровень мутантных клеток по локусу гликофорина А
422 Влияние малых доз хронического облучения на уровеньмутантных клеток по TCR-локусу
43 Повышенная частота мутантных клеток как критерий дляформирования группы риска развития онкологическихзаболеваний 82ВЫВОДЫ 88СИИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 90Список использованных сокращенийBDISTCRGPAЛПКБСАИПБОФСБФИТЦФЭРЩЖЩЖМАТНЬА- Becton Dickinson Immunocytometry Systems- Т-клеточный рецептор- гликофорин А- лимфоциты периферической крови- бычий сывороточиый альбумин- йодистый пропидий- буфер для окрашиваиия- фосфатно-солевой буфер- флуоресцеин изотиоционат- фикоэритрин- рак щитовидной железы- щитовидная железа- моноклональные антитела-гемоглобин А
Введение:
На протяжении последних десятилетий радиобиологи активностараются оценить риск для здоровья человека от воздействияионизирующего излучения (ИИ) (особенно интересен диапазон малых доз). Вотличие от воздействия РШ в больших дозах, которое может вызыватьсущественные нарушения здоровья, в том числе лучевую болезнь и гибельорганизма, ИИ в малых дозах не всегда вызывает видимыеморфофункциональные изменения у живых организмов. Тем не менее,многочисленные литературные данные показывают, что ИИ в малых дозахиндуцирует комплекс цитогенетических, биохимических и биофизическихизменений в клетках организма животных и человека (Бурлакова и др., 1996,1999; Пелевина и др., 2003; Mothersill and Seymour, 2003). Хотя механизмыдействия малых доз Р1И все еще остаются недостаточно изученными, можнопредположить, что с обнаружением феномена радиационно-индуцированнойнестабильности генома у потомков облученных клеток, большую значимостьприобретают исследования изменений генетического материала, особенноинтересно изучение проявлений этого явления на генном уровне приоблучении человека в диапазоне малых доз. В связи с этим представляетинтерес исследование генных мутаций в соматических клетках людей,подвергающихся низкоинтенсивному радиационному воздействию в малыхдозах вследствие проживания на загрязненной радионуклидами территории.Одно из самых неблагоприятных последствий воздействия радиации индукция злокачественных новообразований. Радиационное воздействиеиграет роль пускового механизма в канцерогенезе, а дальнейшее развитиесобытий зависит от состояния репарационной, иммунной, эндокринной идругих систем организма, ответственных за реакцию организма наповреждающее воздействие. При обследовании людей, облученных в малыхдозах вследствие проживания на загрязненных территориях, показано, чтотолько у части лиц развиваются вредные последствия. С 1992 г. имеет месте7драматический рост числа заболевших РЩЖ, особенно среди тех лиц, ктонаходился в детском возрасте на момент аварии, посколькурадиочувствительность ЩЖ особенно высока у детей младшего возраста. Внастоящее время в Брянской и Орловской областях показательзаболеваемости РЩЖ для лиц, облученных в детском возрасте, в 3-5 разпревышает аналогичный по стране в целом. В связи с этим проблемавыявления групп повышенного канцерогенного риска является одной изсамых актуальных.Поскольку известно, что мутации играют ключевую роль вканцерогенезе, то подход для выявления групп повышенного канцерогенногориска, основанный на оценке уровня соматического мутагенеза в организме,можно рассматривать как один из наиболее перспективных. Правомерностьтакого подхода следует из представления, что возникновение мутаций, какправило, является стохастическим процессом, поэтому можно предположить,что количество клеток с мутациями в любом гене (в том числе и не имеющемпрямого отношения к канцерогенезу) отражает общий уровеньсоматического мутагенеза в организме. В таком случае, лица с высокойчастотой мутаций в генах, даже непосредственно не связанных созлокачественной трансформацией, будут составлять группу риска вотношении развития опухолей. Известные к настоящему времени факты(Hagmar et al., 1994; Akiyama et al, 1995, b; Grant et al., 1999; Замулаева и др.,2001; Орлова, 2002), подтверждают эту гипотезу.Таким образом, не вызывает сомнений актуальность исследованиясоматического мутагенеза в отдельных генных локусах после радиационноговоздействия. Среди существующих методов определения генных мутацийнаиболее перспективными следует считать проточноцитометрическиеметоды выявления клеток, мутантных по локусу Т-клеточного рецептора(TCR -тест) и по локусу гликофорина А (GPA -тест). До недавнего времениэти тесты использовались наряду с традиционными методами определенияструктурных мутаций для ретроспективной дозиметрии (Langlois R.G. et al. 81987 ; Akiyama М et al, 1991; Саенко и др., 1998, 2000). В отношениииспользования этих методов для выявления лиц с высоким уровнемсоматического мутагенеза в литературе имеется всего несколько публикаций(Akiyama et al., 1995; Замулаева и др., 2001), однако они свидетельствуют оперспективности применения этих методов для формирования группповышенного риска развития онкологических заболеваний ряда локализаций.В отношении патологии щитовидной железы (ЩЖ) подобных исследованийне проводилось. Поэтому исследование потенциальной возможностииспользования оценки уровня соматических генных мутаций у больныхРЩЖ, проживающих в загрязненных радионуклидами районах, представляетособый интерес в связи с повышенной частотой заболеваний ЩЖ и с тем,что РЩЖ у части таких больных обусловлен радиационным воздействием. Внастоящее время доказано, что облучение ЩЖ ионизирующим излучениемприводит к увеличению частоты как злокачественных, так идоброкачественных заболеваний ЩЖ. Поскольку доброкачественныеузловые новообразования в ЩЖ часто ведут к злокачественнойтрансформации, то исследование уровня генных мутаций в соматическихклетках у лиц с выявленной узловой патологией ЩЖ и проживающих н?.загрязненных радионуклидами территориях, позволит судить о возможностииспользования методов определения генных мутаций для формированиягрупп повышенного риска развития РЩЖ. Таким образом, целью данной работы являлось выяснение несколькихвопросов. Первый из них - действительно ли у лиц, проживающих назагрязненных радионуклидами территориях, и больных РЩЖ наблюдаютсяповышенные частоты клеток с генными мутациями. Второй - является липрименение GPA- и TCR-тестов перспективным для формирования групприска в отношении возникновения РЩЖ. Интерес представляла такжеоценка информативности указанных тестов для биодозиметрии при разныхдозах облучения щитовидной железы.9Для достижения данной цели предполагалось решить следующиезадачи:1) провести сравнительное исследование частоты мутантных клеток по TCRи GPA-локусам у жителей загрязненных в результате аварии на ЧАЭСрайонов и необлученных контрольных лиц;2) установить, суш,ествует ли зависимость между дозой, поглощенной ЩЖ,и частотой мутантных клеток по GPA- и TCR-локусам у жителейзагрязненных в результате аварии на ЧАЭС районов (на примере жителейОрловской области);3) провести сравнительное исследование частоты мутантных клеток по 2указанным локусам у жителей Орловской области с выявленнойдоброкачественной узловой патологией ЩЖ и без таковой;4) провести сравнительное исследование частоты мутантных клеток по 2указанным локусам у больных РЩЖ до лечения и у здоровых лиц;5) оценить возможность использования данных тестов для формированиягрупп риска в отношении возникновения РЩЖ;Научная новизна работыВ результате проведенных исследований показано, что у жителейзагрязненных территорий, подвергающихся хроническому облучению вмалых дозах, средняя частота клеток с генными мутациями по TCR- и поGPA-локусам статистически значимо превышает контрольный уровень.Однако для всех обследованных лиц не установлено прямой зависимостивыхода этих мутантных клеток от степени загрязнения радионуклидамиразличных районов. Показано, что у постоянных жителей загрязненныхтерриторий Орловской области с доброкачественной узловой патологиейщитовидной железы средняя частота клеток с генными мутациями по TCRлокусу статистически значимо превышает не только контрольный уровень,но и этот показатель у жителей Орловской области без такой патологии. Врезультате исследования впервые были получены данные о частоте10мутантных клеток по TCR- и по GPA-локусам у больных раком щитовиднойжелезы до начала специфического лечения.Практическая значимость работыРезультаты обследования жителей радиоактивно загрязненныхтерриторий с доброкачественной узловой патологией ЩЖ, а такжепациентов со злокачественными новообразованиями ЩЖ свидетельствуют овозможности выявления лиц, в том числе среди подвергшихся действиюионизирующих излучений в малых дозах, с повышенным риском развитияРЩЖ, основываясь на показателях соматического генного мутагенеза вразных локусах (прежде всего, по TCR-локусу).Основиые положения, выносимые иа защиту1. У жителей Орловской области, подвергающихся хроническомунизкоинтенсивному радиационному воздействию в малых дозах(плотность загрязненности по Cs'^^ 6,6-213 кБк/м^) наблюдается высокаячастота клеток с генными мутациями по разным локусам.2. В отдаленные сроки после облучения в малых дозах выход клеток сгенными мутациями прямо не зависит от величины дозовой нагрузки нащитовидную железу в диапазоне доз 0,41-641 мГр.3. Лица с доброкачественной узловой патологией щитовидной железы ибольные раком щитовидной железы имеют более высокие частоты клетокс мутациями по локусу Т-клеточного рецептора. Вероятно, повышенныйуровень частоты клеток с генными мутациями может являться критериемдля формирования группы лиц с высоким риском развития РЩЖ. Аиробаиия работыПо теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.Основные результаты диссертационной работы доложены на следующихконференциях:• Международный конгресс «Энергетика 3000 (энергетика и человек)»,2001г., Обнинск; Международная щкола - конференция молодых ученых"Биология - наука XXI века", 2003 г., Пущино; III съезд по радиационным11исследованиям (радиобиология и радиоэкология), 2003 г., Киев; V съездпо радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология,радиационная безопасность), 2006 г., Москва; International summer school"Molecular mechanisms in homeostasis and disease", 2003r., Greece; Canceiimmunology and immunotherapy summer school, 2003 г., Greece; 35* AnnualMeeting of the European Environmental Mutagen Society, 2005 г., Kos,Greece.Диссертация апробирована на научной конференцииэкспериментального радиологического сектора ГУ-МРНЦ РАМН «20»апреля 2006 г.Структура и объем диссертации.Диссертация изложена на 102 страницах печатного текста,иллюстрирована 30 таблицами, 13 рисунками. Работа состоит из введения,
