Справка: Фокина, Виктория Валерьевна. Конверсия 3-кетостероидов Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.23 Пущино, 2003 153 c. : 61 04-3/528
Объем: 153 стр.
Информация: Пущино, 2003
Содержание:
1 ВВЕДЕНИЕ
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
21 Биоконверсия 9( 11 )-дегидро-3-кетостероидов
22 Микробиологическое 1(2)-дегидрирование 3-кетостероидов
221 Распространенность 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназной (3-КСД) 13 активности среди микроорганизмов
222 Свойства 3-КСД
223 Сходство строения и механизма действия 3-КСД и других дегидрогеназ
224 Механизм 1 (2)-дегидрирования 3-кетостероидов на примере 3-КСД 19 Nocardia corallina
225 Субстратная специфичность 3-КСД
226 Локализация 3-КСД
227 Связь 3-КСД с другими ферментными системами клетки
23 Реклассификация штаммов рода Arthrobacter
231 Современная систематика микроорганизмов
232 Признаки, используемые для классификации и идентификации 26 актиномицетов
233 Переописание штаммов, ранее отнесенных к роду Arthrobacter
24 Биоконверсия труднорастворимых субстратов
241 Конверсия стероидных субстратов в микрокристаллической форме
242 Использование специальных реакторов для биоконверсии
243 Использование органических растворителей
244 Использование полимеров
245 Использование циклодекстринов и их производных 33 25 Культивирование микроорганизмов 39 251 Режим с периодической подпиткой 39 252 Варианты стратегии управлением режима с подпиткой
3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 42 31 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
311 Реактивы
312 Микроорганизмы и методы их культивирования 42 3121 Штаммы, использованные в работе 42 3122 Среды для выращивания микроорганизмов
3123 Условия культивирования "Arthrobacter globiformis 193"
3124 Фракционирование (получение ЦПМ)
3125 Трансформация стероидных субстратов
313 Микроскопия
3131 Электронная микроскопия
3132 Световая микроскопия
314 Аналитические методы
3141 Анализ продуктов трансформации
3142 Масс-спектрометрический анализ
3143 ЯМР-спектрометрия
3144 Определение концентрации белка
3145 Определение растворимости стероидов
315 Таксономические методы
3151 Определение чувствительности к антибактериальным препаратам
3152 Определение способности утилизировать сахаро-спирты в качестве 49 единственного источника углерода
3153 Определение гидролазной активности
316 Определение основных хемотаксономических признаков
3161 Очищенные препараты клеточных стенок
3162 Определение изомера диаминопимелиновой кислоты
3163 Определение аминокислотного состава полученных препаратов 50 пептидогликанов
3164 Полуколичественное определение менахинонов
3165 Состав жирных кислот
317 Определение последовательности гена 16S рРНК
318 Филогенетический анализ 51 32 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
321 Ре-идентификация штамма "Arthrobacter globiformis 193"
322 Биоконверсия ацетилированных 9(11 )-дегидро-3-кетостероидов
3221 Конверсия прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона
3222 Конверсия 21 -ацетата прегна-4,9( 11 )-диен-17а,21 -диол-3,20-диона
3223 Конверсия 17а,21-диацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20-диона
3224 Конверсия 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона
323 Выращивание уплотнённой культуры N simplex ВКМ Ас-2033Д
4 ВЫВОДЫ
Введение:
Актуальность проблемы.
Физиологическая активность 1(2)-дегидрированных стероидов определяет их широкое использование в терапии многих заболеваний в онкологии, дерматологии, для эффективного лечения больных ревматизмом, инфекционным неспецифическим полиартритом, бронхиальной астмой, различными аллергическими заболеваниями. Иммунодепрессивные свойства этих препаратов используют при трансплантации органов и тканей для подавления реакции отторжения. В сравнении с 1(2)-насыщенными предшественниками 1(2)-дегидростероиды являются более эффективными и вызывают меньше побочных реакций.
Известное с 50-х годов микробиологическое 1(2)-дегидрирование стероидов является основой промышленных технологий получения преднизолона и других преднистероидов. Однако современное развитие Фарминдустрии ставит задачи повышения эффективности процессов 1(2)-дегидрирования 3-кето-стероидов, вводя при этом жесткие ограничения по применению токсических реагентов и растворителей, а также разработки эффективных способов получения широкого ряда современных лекарственных средств, в том числе, галогенированных кортикоидов, в синтезе которых большая роль отводится микробиологическому 1(2)-дегидрированию 3-кето-9(11)-ненасыщенных стероидов.
В связи с этим, актуальным является изучение влияния структурной модификации 3-кетостероидов на процесс их микробиологического 1(2)-дегидрирования, изучение взаимосвязи процесса 1(2)-дегидрирования с другими реакциями метаболизма 3-кетостероидов, разработка способов интенсификации и повышения селективности процесса 1(2)-дегидрирования.
Выбор объекта исследований - культуры Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д (Arthrobacter globiformis 193) обусловлен его высокой 3-КСД активностью в отношении широкого ряда стероидных субстратов: андростендиона, прогестерона, гидрокортизона, ба-метилгидрокортизона, кортексолона и его 21-ацетата (Суходольская с соавт., 2000; Аринбасарова с соавт., 1995). Высокий биотехнологический потенциал штамма как продуцента стероидных 1(2)-дегидроаналогов предусматривал уточнение его таксономического положения.
Состояние вопроса.
Традиционно двойная связь между С1 и С2 в кольце А стероидов вводится либо на начальных, либо на конечных этапах синтеза (Bork et al., 1968). Изучены особенности процесса дегидрирования гидрокортизона, его ба-метилированного производного, разработаны эффективные методы получения преднизолона и других дегидроаналогов (Аринбасарова с соавт., 1984; Аринбасарова с соавт., 1995). Исследованы свойства 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназы (3-КСД) у многих организмов (Nocardia corallina, Rhodococcus erythropolis, Arthrobacter simplex). Показано существование нескольких изоформ фермента различной локализации (Geize et al., 2002). На процессе биоконверсии гидрокортизона исследована взаимосвязь 1(2)-дегидрирования и 20р-восстановления у Arthrobacter globiformis (Medentsev et al, 1985).
Однако, литературные данные о 1(2)-дегидрировании 9(11)- и 9(11), 16(17)-ненасыщенных 3-кетостероидов ограничены. Сообщалось о том, что процесс конверсии может сопровождаться нежелательной ароматизацией кольца А, либо деструкцией стероидного ядра (Wolf and Kominek, 1984). Данные о возможности биоконверсии ацетатных форм Д4,9(||)-3-кетостероидов в доступной литературе отсутствуют.
Показана высокая 3-КСД активность штамма "Arthrobacter globiformis 193" из рабочей коллекции лаборатории микробиологической трансформации органических соединений ИБФМ РАН в отношении гидрокортизона, ба-метилгидрокортизона, и других стероидных субстратов (Аринбасарова с соавт., 1995).
Анализ диаминокислоты клеточной стенки показал, что штамм имеет LL-диаминопимелиновую кислоту, что отличает его от представителей рода Arthrobacter, для которых характерен пептидогликан А4 с лизином в качестве диаминокислоты. Представлялось актуальным определить соответствующее таксономическое положение штамма с использованием современных методов классификации микроорганизмов.
Биоконверсия многих стероидов осложнена их низкой растворимостью в водных средах. Так, растворимость гидрокортизона составляет менее 0.4 г/л, растворимость 9(11 )-дегидрокортексолона и его ацетилированных форм - в несколько раз ниже. Предложены различные способы решения проблемы доступности стероидных субстратов клеточному биокатализатору, в том числе основанные на использовании органических растворителей и детергентов (Аринбасарова и Кощеенко, 1983; Кощеенко с соавт., 1995). Одним из наиболее эффективных подходов является использование циклодекстринов. Эти биосовместимые циклические олигосахариды образуют с гидрофобными стероидными соединениями комплексы включения, таким образом, оказывая на стероиды солюбилизирующий эффект (Duchenc, 1991). 6
Эффективность использования циклодекстринов была показана для многих процессов конверсии стероидов, в том числе для 1(2)-дегидрирования гидрокортизона и 6а-метилгидрокортизона (Кощеенко с соавт., 1995). Однако эффективность использования природных циклодекстринов (например, Р-циклодекстрина) для повышения эффективности биоконверсии имеет ограничения, связанные как с их растворимостью, так и с растворимостью их комплексов включения со стероидами (Fromming and Szejtli, 1994), поэтому наиболее целесообразным представляется использование в процессах биоконверсии водорастворимых модифицированных производных Р-циклодекстрина.
Осуществление 1 (2)-дегидрирования 3-кетостероидов отмытыми клетками на буферной среде обеспечивает высокую скорость и селективность процесса, облегчает процедуру выделения и очистки целевого продукта, снижает риск контаминации. Однако эффективность такого подхода требует применения высокопроизводительных способов получения биомассы с высокой целевой активностью. Одним из таких приемов является получение уплотнённой культуры, обеспечивающее достижение высокой биомассы при сокращении числа стадий выращивания. В литературе описаны способы получения уплотнённых нокардиеподобных культур (Fass et al., 1995; Honda et al., 1998; Ikeda and Katsumata, 1999), однако, сведения о получении уплотнённых культур со стероидтрансформирующей активностью в литературе отсутствуют.
Цель и задачи работы.
Целью данной работы являлось изучение конверсии Д4,9(П'-3-кетостероидов и их ацетилированных производных культурой Nocardioides simplex ВКМ Лс-2033Д {Arthrobacter globiformis 193) и разработка способов получения их 1(2)-дегидроаналогов.
В связи с этим ставились следующие задачи:
1. Определение таксономического положения штамма "A. globiformis 193" с использованием современных методов классификации микроорганизмов.
2. Изучение возможности 1 (2)-дегидрирования ацетилированных Д4,9(П)-3-кетостероидов.
3. Исследование особенностей биоконверсии ацетилированных Д4-9<||)-3-кетостероидов в присутствии метилированного производного Р-циклодекстрина (МЦД).
4. Получение уплотнённой культуры N. simplex ВКМ Ас-2033Д с высокой стероид-1 (2)-дегидрогеназной активностью.
5. Разработка методов получения 1 (2)-дегидроаналогов Д49("'-3-кетостероидов и их ацетилированных производных.
Научная новизна работы.
Впервые показана возможность микробиологического 1(2)-дегидрирования ацетилированных 3-кетостероидов, ненасыщенных по кольцу С и D. Исследованы особенности метаболизма 21-моно- и 17а,21-диацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21диол-3,20-диона культурой Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д. Показано, что 1(2)дегидрирование сопровождается дезацетилированием в положении 21 и 20(3восстановлением. Впервые показана неферментативная миграция ацетильной группы из положения 17 в положение 21 при микробиологической конверсии 17а,21-диацетата д4,93-кехостероидов.
Изучены особенности микробиологического дезацетилирования 21-моно- и 17а,21-диацетатов А4'9( 11-3-кетостероидов, выявлен конститутивный характер стероидных эстераз Nocardioides simplex, а также их цитозольная и мембраносвязанная локализация.
Изучен биотехнологический потенциал бактерий рода Nocardioides в отношении 1(2)-дегидрирования стероидов и установлены преимущества использования штамма Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д, ранее классифицированного как Arthrobacter globiformis 193.
Исследованы особенности трансформации Д4,9(П-3-кетостероидов в присутствии химически модифицированных циклодекстринов. Показано, что ведение процесса в присутствии метилового эфира p-циклодекстрина обеспечивает полную конверсию 3-кетостероидов при высоких (5 г/л) концентрациях.
Разработан способ получения уплотнённой культуры N. simplex ВКМ Ас-2033Д с высокой 3-КСД активностью. Предложены эффективные методы получения 1(2)-дегидроаналогов Д4,9(| '-3-кетостероидов.
Практическая значимость работы.
Определены условия эффективной конверсии клетками N. simplex ВКМ Ас-2033Д ацетатных форм 3-кетостероидов, ненасыщенных по кольцу С и D, и предложены эффективные микробиологические методы получения 21-ацетата прегна-1(2),4,9(11)-триен-17а,21-диол-3,20-диона, 17а-ацетата прегна-1(2),4,9(11)-триен-3,20-дион-17а,21 -диола, 21 -ацетокси-прегна-1 (2),4,9( 11), 16( 17)-тетраен-3,20-диона.
Применение разработанных методов при получении фторированных кортикостероидов позволит заменить многостадийный и низкоэффективный химический синтез этих соединений и повысить эффективность технологий получения лекарственных субстанций в целом.
Разработан способ получения уплотнённой культуры N. simplex ВКМ Ас-2033Д с высокой 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназной активностью. Применение способа позволит избежать затратного многоэтапного культивирования биомассы при масштабировании биотехнологий.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на 5-ой Пущинской конференции молодых ученых (2001), International Symposium "Biocatalysis and Biotransformations" Biotrans-2001, (2001, Darmstadt), Biotrans-2003 (2003, Olomouc), на ежегодном конкурсе научных работ ИБФМ РАН (2001).
Основные положения диссертации были представлены на совместных семинарах Лаборатории микробиологической трансформации органических соединений и Лаборатории энзиматической деградации органических соединений.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 статьи и 3 тезисов.
Структура и объём диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа содержит 144 страницы машинописного текста, 17 таблиц и 48 рисунков. Библиография включает 179 наименований, из них 137 иностранных работ.
