Главная » 2014 » Август » 30 » Скачать Хитинолитическая активность ферментов у некоторых беспозвоночных Баренцева моря. Рысакова, Кира Сергеевна бесплатно
00:18
Скачать Хитинолитическая активность ферментов у некоторых беспозвоночных Баренцева моря. Рысакова, Кира Сергеевна бесплатно
Хитинолитическая активность ферментов у некоторых беспозвоночных Баренцева моря
Диссертация
Автор: Рысакова, Кира Сергеевна
Название: Хитинолитическая активность ферментов у некоторых беспозвоночных Баренцева моря
Справка: Рысакова, Кира Сергеевна. Хитинолитическая активность ферментов у некоторых беспозвоночных Баренцева моря : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.04 / Рысакова Кира Сергеевна; [Место защиты: Карел. гос. пед. ун-т] Мурманск, 2008 145 c. : 61 08-3/721
Объем: 145 стр.
Информация: Мурманск, 2008
Содержание:
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 Строение, свойства и применение хитина и его производных
1 2 Пути деградации хитина в природе
13 Гидролитические ферменты беспозвоночных
131 Протеолитические ферменты
132 Характеристика и действие хитинолитических ферментов
133 Хитозаназа
134 Хитиндеацетилаза
14 Ферменты других классов, гидролизующие хитин и хитозан
15 Распространенность хитиназ в природе
16 Хитиназы ракообразных
17 Изменение сезонной активности хитиназ у различных видов беспозвоночных
18 Физико-химические свойства хитиназ
19 Преимущество ферментативного гидролиза хитина и хитозана
110 Применение хитинолитических ферментов
1101 Применение хитинолитических ферментов в защите растений
1102 Применение хитинолитических ферментов в медицине
ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
21 ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
22 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
221 Получение ферментного препарата
222 Приготовление субстратов
223 Методики определения хитиназной активности
224 Определение протеолитической активности
225 Определение гликолитической активности
2251 Методика определения восстанавливающих Сахаров после ферментативного гидролиза полисахаридов (хитина, хитозана)
226 Хроматографическое определение D-глюкозамина
227 Определение средневязкостной молекулярной массы хитозана
228 Определение степени деацетилирования хитозана
229 Определение степени деацетилирования хитина и хитозана методом инфракрасной спектроскопии
210 Проведение фракционирования
211 Определение химической чистоты
212 Математическая и статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
31 Хитинолитическая активность ферментов морских беспозвоночных
32 Свойства хитинолитических ферментов краба
321 Зависимости экзо- и эндохитиназной активности от продолжительности инкубации
322 Зависимость экзо- и эндохитиназной активности от температуры
323 Зависимость экзо- и эндохитиназной активности от рН
324 зависимость а экзо- и эндохитиназной активности от концентрации ферментного препарата
33 Обнаружение хитозаназной и деацетилазной активности, влияние степени ацетилирования субстрата
34 Обнаружение гликолитической активности в ферментном препарате из гепатопанкреаса камчатского краба
341 Методика определения восстанавливающих Сахаров
342 Кинетика образования суммы восстанавливающих Сахаров и ацетнлглюкозамина
343 Влияние рН на ферментную активность
344 Влияние температуры на ферментную активность
345 Влияние концентрации реагентов на степень ферментативного гидролиза
35 Хроматографическое определение D-глюкозамина
36 Выделение фракций ферментов, обладающих максимальной активностью
Введение:
Актуальность проблемы. В пищеварительных органах всех живых организмов присутствует широкий набор гидролитических ферментов. Огромный интерес к изучению физиологических функций этих ферментов и механизмов гидролиза объясняется их значительной ролью в обмене веществ у животных.
К настоящему времени, данные, имеющиеся в литературе, в большей степени посвящены ферментам рыб и практически не касаются хитиназ беспозвоночных (Сидоров, 1980; Немова, 1996; Высоцкая, 1999; Кузьмина, 2005). Вместе с тем моллюски, ракообразные и иглокожие являются одними из наиболее древних и многочисленных в видовом отношении животных. Изучение биохимических принципов, обеспечивающих их жизнедеятельность, облегчает понимание биохимических процессов у организмов высших таксонов (Сравнительная физиология., 1977; Мухин, 1999).
Актуальность изучения гидролаз морских беспозвоночных определяется, с одной стороны, функциями, которые выполняют эти ферменты в организме, а с другой - их несомненной практической значимостью. Особый интерес представляет изучение вопросов, связанных с такими хозяйственно-ценными объектами, как ракообразные и моллюски. Исследование ферментов беспозвоночных позволяет более рационально использовать добываемое сырье для получения препаратов ферментов и применения их в медицине, микробиологии, пищевой, комбикормовой и легкой промышленности (Мухин, 2002).
Важным направлением использования хитинолитических ферментов в медицине является получение различных неогликоконъюгатов, применяемых в медицине для ингибирования процесса метастазирования при онкопатологии. Производные хитина, такие как хитоолигосахариды и олигосахариды хитозана, получаемые с помощью хитинолитических ферментов, также обладают многими важными и полезными для здоровья свйствами, проявляют противоопухолевое действие, улучшают функции кишечника (последнее объясняется способностью стимулировать рост Bifidobacteria — полезной кишечной бактерии, которая помогает справляться со многими болезнями пищеварительного тракта.
Кроме того, в последние десятилетия широкое распространение получил микробиологический метод защиты растений - использование препаратов на основе Bacillus thuringiensis, выделяющей хитинолитические ферменты. Перенос гена хитиназы в клетки растений позволил сделать их носителями собственного инсектицида (Журавлева, 2004).
Ферментативный гидролиз хитина и хитозана является альтернативным и, как считают многие биохимики, перспективным и более предпочтительным способом переработки хитина и хитозана по сравнению с уже традиционными химическими методами (Sashiwa, 2001; Ильина, 2002).
Акклиматизированный в Баренцевом море камчатский краб не только ценный промысловый вид, но и потенциальный объект аквакультуры. Основные биологические показатели камчатского краба Paralithodes camtschaticus в Баренцевом море не имеют существенных отличий от таковых в естественных популяциях его обитания в Тихом океане. Однако особенности экологии Баренцева моря, по всей вероятности, могут оказывать влияние на соотношение частей тела, химический состав и биохимические свойства мяса, гепатопанкреаса и других внутренних органов краба. Сведения об этих параметрах важны для обоснования возможности использования этого объекта на пищевые цели, а также для разработки комплексной технологии переработки сырья. Анализ научной литературы свидетельствует о том, что к настоящему времени при переработке камчатского краба используются практически все части тела. Из панциря получают производные хитина. Гепатопанкреас представляет собой ценное сырье для получения ферментных препаратов и жиров (Камчатский краб., 2003).
Проблема утилизации отходов промысла и переработки камчатского краба весьма актуальна с точки зрения не только рационального использования добытого сырья, но и получения разнообразных продуктов, находящих широкое применение в медицине и промышленности. (Мухин, 1998).
Отходы промысла и переработки камчатского краба содержат значительное количество таких неутилизируемых соединений, как белки, хитин, липиды и ферменты.
Пищеварительные органы различных морских беспозвоночных, и, особенно, гепатопанкреас ракообразных являются уникальным сырьем для получения ферментов. Этот вопрос является предметом детального изучения огромного количества научных работ (Jeuniaux, 1963; Сахаров, 1992; Shigemasa, 1994; Руденская, 1995; Климова, 1999). В ПИНРО также проводятся работы по исследованию протеолитической и хитинолитической активности гепатопанкреаса камчатского краба (Мухин, 1999; Новиков, 2007).
Цель и задачи исследования. Цель данной работы - исследование хитинолитической активности в пищеварительных органах некоторых беспозвоночных Баренцева моря и выделение фракций белков, ответственных за ее проявление.
Задачи исследования сводились к следующему:
1. Провести сравнительное изучение хитиназной активности у различных таксономических групп морских беспозвоночных (камчатского краба, серрипеса, трубача, кукумарии, морской звезды)
2. Изучить динамику ферментативного гидролиза хитина и хитозана под действием ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба при различных условиях проведения анализа.
3. Сравнить кинетические характеристики гидролиза хитина (хитозана) под действием ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба.
4. Исследовать природу хитинолитических и протеолитических ферментов и охарактеризовать их молекулярные массы (ММ).
Научная новизна. Впервые установлены основные характеристики хитинолитических ферментов гепатопанкреаса камчатского краба. Определены оптимальные условия гидролиза. Проведено сравнительное исследование хитинолитической активности у морских беспозвоночных различных таксономических групп.
Установлено, что наибольшей хитиназной активностью обладают ферменты, выделенные из камчатского краба и морской звезды. Причем эндохитиназная активность выше у фермента выделенного из морской звезды, а экзохитиназная - из краба. Показано отсутствие хитозаназной активности, в частности, экзохитозаназной активности. Доказано, что за хитиназную и протеазную активность ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба отвечают различные ферменты. Также подтверждена различная природа экзо- и эндохитиназ ферментного препарата. Впервые также установлена молекулярная масса (50,9) кД хитиназы, выделенной из гепатопанкреаса камчатского краба.
Практическое значение работы.
Результаты настоящих исследований и сделанные на их основании выводы расширяют представление о ферментативных системах беспозвоночных и позволяют лучше понять их физиологические особенности.
Получение хитиназ из отходов переработки морских гидробионтов может способствовать решению проблемы комплексного использования водных ресурсов.
Обнаружение хитинолитических ферментов в гепатопанкреасе камчатского краба, позволит расширить области его применения, что повысит рентабельность использования отходов крабового промысла.
Определенные в ходе исследования оптимальные условия гидролиза хитина, могут быть использованы для совершенствования процесса получения олигомеров и мономера хитина - N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), имеющих практическую ценность. При ферментативном гидролизе хитина, по сравнению с химическим гидролизом, происходит образование GlcNAc и не наблюдается выход D-глюкозамина (GlcN). что позволяет получать чистый ацетилированный моносахарид. Мягкие условия ферментативного гидролиза и его избирательность обеспечивают получение целевых и побочных продуктов реакции, соответствующих требованиям экологической безопасности производства.
Основные положения, выдвигаемые на защиту.
1. В пищеварительных органах, полученных из камчатского краба, серрипеса, трубача, кукумарии и морской звезды обнаруживается экзо- и эндохитиназная активность. Наибольшей хитиназной активностью обладают ферменты, выделенные из камчатского краба и морской звезды. Эндохитиназная активность выше у фермента выделенного из морской звезды, а экзохитиназная - из краба.
2. Хитиназная активность фермента, определенная по выходу N-ацетилглюкозамина, увеличивается с увеличением степени ацетилирования субстрата.
3. В гепатопанкреасе камчатского краба отсутствует экзохитозаназная активность.
4. За хитиназную и протеазную активность в гепатопанкреасе краба отвечают различные ферменты. Причем белки, отвечающие за хитиназную активность, имеют большую молекулярную массу (ММ) по сравнению с протеазами.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Российских, региональных и международных конференциях: Пятой региональной науч. студенческой конф. «Естественнонаучные проблемы Арктического региона», Мурманск, 2004; XXV юбилейной конф. молодых ученых ММБИ РАН, Мурманск 2007; 2-ой науч. конф. с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов», Петрозаводск, 2007; Междунар. конф. «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов», Петрозаводск, 2004; Межд. науч.-техн. конференциях «Наука и образование», Мурманск, 2003, 2005, 2006, 2007, 2008; Межд. науч.-практ. конференция «Техника и технологии переработки гидробионтов и сельскохозяйственного сырья», посвященная памяти профессора Н. Н. il
Рулёва, Мурманск, 2008; 10 Int. Chemical and Biological Engineering Conf. -CHEMPOR 2008, Braga, Portugal, 2008; Девятой Междунар. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», 2008; Всеросс. конф. молодых ученых и специалистов, посвященной 90-летию со дня рождения К. Г. Константинова, 2008 г.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, включающих 7 статей, из которых 4 — в реферируемых источниках.
Структура и объем работы: Диссертация изложена на 145 страницах, включает 4 таблицы и 33 рисунка. Работа включает введение, 3-й главы, заключение, выводы, список сокращений и список литературы, включающий 184 публикации, из них 105 иностранных.
