Главная » 2014 » Июль » 28 » Скачать Использование молекулярных маркеров для установления филогенетических взаимоотношений видов в родах Triticum L. и Iris L. бесплатно
03:50
Скачать Использование молекулярных маркеров для установления филогенетических взаимоотношений видов в родах Triticum L. и Iris L. бесплатно
Использование молекулярных маркеров для установления филогенетических взаимоотношений видов в родах Triticum L. и Iris L.
Диссертация
Автор: Головнина, Ксения Александровна
Название: Использование молекулярных маркеров для установления филогенетических взаимоотношений видов в родах Triticum L. и Iris L.
Справка: Головнина, Ксения Александровна. Использование молекулярных маркеров для установления филогенетических взаимоотношений видов в родах Triticum L. и Iris L. : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.15 / Головнина Ксения Александровна; [Место защиты: Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН] Новосибирск, 2008 142 c. :
Объем: 142 стр.
Информация: Новосибирск, 2008
Содержание:
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 ИСТОРИЯ, РАЗВИТИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ
112 Появление ДНК маркеров
1121 RFLP (restriction fragment length polymorphism) — полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
1122 Минисателлиты (minisatellites)
113 Молекулярные маркеры, основанные на методе ПЦР
1131 Микросателлиты (microsatellites)
1132 RAPD и производные методы
114 Полиморфизм последовательностей ДНК
1141 Полиморфизм единичных нуклеотидов - SNP (single nucleotide polymorphism)
1142 Секвенирование ДНК
1143 Маркеры на основе последовательностей транскриптонов (EST)
12 ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ
121 Геномный анализ и селекция растений
122 Поиск «генов-кандидатов» с использованием генетической карты
123 Геномика и eQTL (ExpressQTL)
124 Изучение генетических перестроек, произошедших в процессе эволюции
125 Филогенетические исследования
13 ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ, ОСНОВАННЫЙ НА АНАЛИЗЕ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК
131 Методы дифференциального гель-электрофореза
132 Свойства молекулярно-генетического маркера
133 Последовательности хлоропластной ДНК в качестве молекулярно-генетических маркеров
1331 Хпоропластный геном
1332 Скорость эволюции хлоропластной ДНК
1333 Использование хлоропластной ДНК в филогении растений
134 Молекулярно-генетические маркеры, основанные на ядерных последовательностях
15 ФИЛОГЕНИЯ ВИДОВ РОДА IRIS L
16 ФИЛОГЕНИЯ ВИДОВ РОДА TRITICUM L
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
21 РАСТИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ
22 ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА СУММАРНОЙ ДНК ИЗ РАСТЕНИЙ
23 RAPD АНАЛИЗ
24 АМПЛИФИКАЦИЯ ОПРЕДЕЛЕННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
25 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ПРОДУКТОВ ПЦР В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ, ИХ ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА
26 КЛОНИРОВАНИЕ ФРАГМЕНТОВ ДНК, ПОЛУЧЕННЫХ МЕТОДОМ ПЦР
27 ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК
28 ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ КЛОНИРОВАННЫХ ФРАГМЕНТОВ
29 ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
31 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ «НЕПРЯМЫХ» МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ ФИЛОГЕНИИ
311 RAPD анализ сибирских видов рода Iris
32 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КАЧЕСТВЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ХЛОРОПЛАСТНОЙ ДНК
321 Поиск ДНК маркера для реконструкции филогении рода Iris
322 TrnT - trn? район хпДНК как маркер для реконструкции филогении
3221 Филогения рода Iris
3222 Филогения рода Triticum
323 7гиАГинтрон с внутренним matK геном хпДНК как маркер для реконструкции филогении
3231 Построение филогении рода Triticum: анализ нуклеотидных последовательностей
3232 Анализ топологии филогенетического древа
33 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЯДЕРНОЙ ДНК КАК МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКЕРА
331 Специфическая амплификация В генома пшениц
332 Происхождение А генома пшениц
333 Основные дополнения в эволюционном сценарии и происхождении видов рода Triticum
Введение:
Актуальность
Проблема построения естественной классификации живых существ, отражающей их филогенетическую историю, всегда была важна для эволюционных биологов, так как нередко возникают спорные моменты, и их разрешение является одной из задач современной филогении. Ранее традиционным было построение филогенетических и классификационных систем на основании сравнения морфо-анатомических признаков и кариологических данных. Но высокий уровень гомоплазии, чрезвычайное разнообразие морфо-экологических характеристик и многочисленные хромосомные вариации приводят к усложнению работы с этими признаками. В настоящее время основным подходом таксономистов становятся многочисленные методы с использованием молекулярных маркеров, а также анализ непосредственно нуклеотидных последовательностей ДНК и построение на основе полученных данных филогенетических деревьев для тех или иных таксонов, что позволяет существенно дополнить и уточнить традиционные классификационные системы. На высоких таксономических уровнях (семейства и выше) применение молекулярных данных для эволюционной реконструкции оказывается наиболее целесообразным, так как корректная оценка гомологичных морфологических характеристик здесь невозможна. Сопоставление количественных данных, полученных при помощи современных молекулярно-биологических методов, с палеонтологическими датировками позволяет проводить временную оценку дивергенции изучаемых таксонов.
Выбор того или иного метода и молекулярного маркера, вариабельность которого будет положена в основу работы, является одной из важных задач для исследователя. Некодирующие последовательности ДНК имеют большую частоту мутаций по сравнению с кодирующими последовательностями, поэтому они могут использоваться для получения филогенетической информации на внутривидовом и внутриродовом таксономических уровнях (Taberlet et al., 1991, 2006). При помощи алгоритмов, реализованных на базе современных компьютеров, анализ полученных данных проводится быстро и не требует громоздких вычислений "вручную".
Хлоропластный геном представляет собой исключительно удобный объект для исследования филогении растений, благодаря многокопийности и единообразию молекул хпДНК. Более того, хлоропластная ДНК имеет относительно низкий молекулярный вес и при необходимости может быть выделена в чистом виде. Несмотря на небольшую длину ДНК, она содержит достаточное количество как кодирующих, так и некодирующих участков, информативных для молекулярно-эволюционного анализа. В среднем первичная структура хпДНК имеет меньшую скорость накопления мутаций в ходе эволюции, чем яДНК. По этой причине, используя хлоропластные маркеры можно анализировать эволюционное родство растений на более высоких филогенетических уровнях. Но, несмотря на низкую скорость эволюции и относительно стабильный нуклеотидный состав генов, с помощью сравнительных молекулярных исследований в хлоропластном геноме обнаружены многочисленные мутационные изменения (Clegg et al., 1994). Все зависит от того, какой участок ДНК выбран для анализа. Поэтому, для достижения необходимого филогенетического разрешения определенного таксономического уровня необходим предварительный анализ и последующий выбор подходящих пластидпых и ядерных последовательностей.
Объектами настоящего исследования стали сибирские виды рода Iris L. (семейство Iridaceae Juss. порядок Liliales Perlep. класс Monocotyledons) и виды рода Triticum L. (семейство Poaceae (R.Br.) Barnhart порядок Poales Small, класс Monocotyledons). Оба рода из класса Monocotyledons обладают уникальными качествами для практической селекции, несмотря на то, что цели, которые преследуют исследователи в программах по выведению новых сортов, различны. Для садоводов-любителей, ландшафтных дизайнеров и селекционеров ирисы интересны, прежде всего, своим неисчерпаемым потенциалом в качестве декоративных растений. Виды рода Iris занимают одно из первых мест в мире, среди цветочных культур по количеству сортов. Ценное эфирное масло, получаемое из цветков, идёт на производство парфюмерной продукции высшего качества. Масло очень дорого, поэтому заменяется синтетическим ироном и др: ароматизаторами. Более того, род служит модельным объектом для исследования интрогрсссивной гибридизации (Martin et al. 2006). По количеству входящих в него видов род Iris является самым обширным в семействе и при этом не имеет согласованной классификации: Представления об эволюционной истории рода также неоднозначны (Родионенко, 1988; Mathew, 1989). Наряду с накоплением большого количества новых данных, которые не всегда согласуются с ранее полученными результатами о родственных взаимоотношениях на основе морфологических, палеонтологических и цитологических данных, происходит анализ и пересмотр эволюционной истории современной флоры. Обширные базы данных, включающие нуклеотидные последовательности большого количества видов, позволят также посредством сравнения ДНК определять новые дополнения в системе.
Филогения пшениц изучается уже очень давно (Гончаров, 2002; McFadden, Sears, 1946; Mandy, 1970; Jaaska, 1980; Tsunewaki, Ogihara, 1983; Kerby, Kuspira 1986; Feldman, Levy 2005). Различные диплоидные виды пшениц и эгилопсов предлагались на роль доноров геномов полиплоидных видов рода Triticum (Kerby, Kuspira, 1986). Интересны с эволюционной точки зрения и другие работы, касающиеся реконструкции ранней дивергенции диплоидных пшениц от предка Aegilops speltoides Tauch. и их близкого родства с эгилопсами подсекции Emarginata секции Sitopsis. Наличие двух типов цитоплазмы в полиплоидных видах рода Triticum предполагает возможность их дифелитического происхождения (Tsunewaki et al., 1976; Mori et al., 1995). Эта гипотеза была основана на ранних гибридологических и цитологических анализах (Lilienfeld and Kihara, 1934). Однако существовало и противоположное мнение (Tanaka et al., 1978).
Таким образом, в настоящее время, очевидно, что сравнительный анализ ДНК является одним из наиболее эффективных методов для изучения филогении и эволюции различных таксонов. Используя молекулярные маркеры возможно подтвердить гипотезы происхождения культурных растений и разрешить имеющиеся несоответствия в трактовках эволюционных событий. Только в недавнее время при развитии молекулярных подходов появляется достоверная информация о том, какими же путями шла эволюция у такой сельскохозяйственной культуры, как мягкая пшеница, и в каком направлении? Какие виды пшениц являются наиболее древними, а какие появились сравнительно недавно?
Известно, что эволюция пшениц шла в два этапа: а) накопление нуклеотидных замен па диплоидном уровне, как у всех других диплоидных организмов, и затем б) полиплоидия, сыгравшая немаловажную роль в истории злаковых, с последующей дивергенцией уже на полиплоидном уровне. Такая филогенетическая картина сильно усложняет стандартные схемы эволюционного анализа, так как требует дополнительного этапа клонирования, обусловленного наличием нескольких близкородственных геномов в одном растении. Поэтому хлоропластный геном в данном случае является очень удобным и часто используется в подобных работах (Yang et al., 2002; Kim et al., 2007). Однородность всех молекул хлоропластов (последовательности подвержены процессам ректификации), их многочисленность, материнское наследование (установлено для всех синтетических видов, включенных в работу) делает хлоропластную ДНК практически основным объектом для молекулярных работ с полиплоидными видами. Более того, полностью установленная нуклеотидная последовательность генома и информация о скорости эволюции определенных участков позволяет выбирать наиболее подходящие молекулярные маркеры (Matsuoka et al., 2002, http://www.shigen.nig.ac.ip/organelle/index.jsp). Однако наряду с развитием современных технологий и увеличением объема знаний остается еще много вопросов в эволюции злаковых, в том числе хозяйственно важных растений, где процессы эволюции происходили в тесном контакте с доместикацией. До сих пор до конца не выяснены вопросы происхождения геномов культурных и диких полиплоидов, а также, как происходили процессы доместикации, какие механизмы ответственны за возникновение того или иного хозяйственно важного признака.
Для ответа на такие вопросы необходимо изучать именно ядерные последовательности ДНК пшениц, и использовать геном-специфичные молекулярные маркеры для амплифицирования последовательности того или иного генома. При экспоненциальном росте геномных проектов и появлении в базах данных последовательностей ДНК различных геномов это становится возможным.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы — разработка и использование молекулярных маркеров для построения филогении растительных таксонов на внутриродовом уровне.
В конкретные задачи работы входило:
1. Установление филогенетических взаимоотношений сибирских видов рода Iris на основе двух различных систем молекулярных маркеров: RAPD анализ и молекулярно-филогенетический анализ хлоропластных последовательностей ДНК.
2. Поиск молекулярных маркеров в хлоропластном геноме для установления родственных взаимоотношений внутри рода Triticum. Построение филогении видов этого рода.
3. Разработка на основе имеющейся в базе данных информации геном-специфичных ядерных маркеров для амплификации трех геномов пшениц (А, В, G).
4. Исследование происхождения А генома пшениц на основе вариабельности хлоропластных и ядерных последовательностей.
Научная новизна работы. Впервые с использованием как пластидных, так и ядерных молекулярных маркеров были установлены филогенетические взаимоотношения сибирских видов рода Iris и всех известных к настоящему моменту видов рода Triticum. Среди включенных в работу пшениц 22 вида и подвида рода Triticum охарактеризованы на молекулярном уровне впервые, их кластеризация с остальными изученными видами пшениц соответствует их геномным формулам. Установлен хлоропластный филогенетический маркер, позволяющий различать эволюционные линии Emmer и Timopheevii. Разработаны геном-специфичные ядерные маркеры на основе последовательностей Асс-1 и Pgk-1 генов для амплификации А, В и G геномов пшениц. Использование таких маркеров позволило уточнить происхождение трех различных геномов пшениц (А,В и G) и выявить полиморфизм А генома у диплоидных видов рода Triticum.
Научно-практическое значение. Эволюционная история тех или иных растительных таксонов всегда играла немаловажную роль для селекционеров, генетиков и ботаников. Тщательно и полно разработанные на основе родственных взаимоотношений классификации видов культурных растений важны для сбора, сохранения и оценки биоразнообразия, для прогноза возможности успешной интрогрессии полезных признаков и генов из видов-сородичей, а также для сертификации сортов. Полученные в данной работе молекулярные маркеры, специфичные для определенного генома полиплоидных пшениц могут быть использованы для установления или подтверждения геномного состава у ископаемых растений или ранее описанных видов, в том числе и синтетических.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 8-ой молодежной и 1(1Х) международной конференциях молодых ботаников (Санкт-Петербург, Россия, 2004, 2006), на 5-ой конференции "Биоинформатика регуляции и структуры генома" (BGRS'2006, Новосибирск, Россия, 2006), на 2-ой центрально-азиатской конференции по злаковым культурам (Чалпан-Ата, Республика Кыргызстан, 2006), на 5-ой европейской конференции по растительной геномике (Венеция, Италия, 2006), на X международной генетико-селекционной школе «Реализация идей Н. И. Вавилова на современном этапе развития генетики, селекции и семеноводства сельскохозяйственных культур» (Новосибирск, Россия, 2007), на международной научной конференции «Современные эволюционные подходы в биологии, медицине и социологии», посвященной 90-летию со дня рождения акад. Д.К. Беляева (Новосибирск, Россия, 2007), на 11-ом конгрессе европейского общества эволюционных биологов (Упсала, Швеция, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
1. Makarevich I., Golovnina К., Scherbik S., Blinov A. Phylogenetic relationships of the Siberian Iris species inferred from noncoding chloroplast DNA sequences // Int. J. Plant Sci., 2003, V.164, P.229-237.
2. K.A. Головнина. Молекулярная филогения сибирских видов рода Iris , основанная на анализе нуклеотидных последовательностей некодирующих участков хлоропластной ДНК // Материалы VIII Молодежной Конференции Ботаников в Санкт-Петербурге, 17-21 мая, 2004, с. 243.
3. Golovnina К., Glushkov S. Molecular phytogeny of the genus Triticum // Proceedings of the I(IX) international conference of young botanists in Saint-Petersburg, May 2126,2006, P. 39.
4. Гончаров Н.П., Кондратенко Е.А., Храброва М.А., Коновалов А.А., Лайкова Л.И., Блинов А.Г., Головнина К.А., Глушков С.А. Рукотворные виды - источник биоразнообразия пшениц. // Агромеридиан, 2006, Т.3(4), С.86-91.
5. Golovnina К., Glushkov S., Blinov A., Mayorov V., Adkison L., Goncharov N. Molecular phytogeny of the genus Triticum L. // Proceedings of the fifth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure - BGRS 2006, Novosibirsk, Russia, July 16-22, 2006, V. 3, P. 147-150.
6. Golovnina K„ Glushkov S., Blinov A., Goncharov N.P. Genome-specific markers for А, В and G Triticum genomes. // Proceedings of the fifth plant genomics european meetings - PLANT GEMS, Venice, Italy, October 11-14, 2006, P. 211.
7. Golovnina K.A., Glushkov S.A., Blinov A.G., Mayorov V.I., Adkison L., Goncharov N.P Phylogeny of the genus Triticum L. Based on chloroplast TrnL and MatK sequences // Proceedings of the fifth plant genomics european meetings - PLANT GEMS, Venice, Italy, October 11-14, 2006, P. 319.
8. Н.П. Гончаров, Е.Я. Кондратенко, C.B. Банникова, А.А. Коновалов, К.А. Головнина. Сравнительно-генетический анализ голозерной диплоидной пшеницы Triticum sinskajae и ее исходной формы Т. топососсит // Генетика, 2007, Т.43(11), С.1491-1500.
9. К. A. Golovnina, S. A. Glushkov, A. G. Blinov, V. I. Mayorov, L. R. Adkison and N. P. Goncharov. Molecular phylogeny of the genus Triticum L. // PI. Syst. Evol., 2007, V.264, P. 195-216.
10. N.P. Goncharov, K.A. Golovnina, B. Kilian, S. Glushkov, A. Blinov, V.K. Shumny. Evolutionary history of wheats - the main cereal of mankind // In. N. Dobretsov et al. (eds.), Biosphere Origin and Evolution, part VI,Springer 2008, P. 407-419. (DOI 10.1007/978-0-3 87-68656-1 29).
11. Kseniya A. Golovnina, Sergey A. Glushkov, Nikolay P. Goncharov, Alexander G. Blinov. The origin of А, В and G Triticum genomes based on molecular data // Proceedings of the XI Congress European Society for Evolutionary Biology - ESEB 2007, Uppsala, Sweden, August 20-25, 2007, P.351.
